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详细的实验时间(原理,试剂,步骤和问题)

时间:2019-06-09 21:54   365bet娱乐在线  

蛋白质印迹实验原理WB是一种将蛋白质转移到膜上并使用抗体检测它的方法。
对于已知表达的蛋白质,相应的抗体可以用作第一抗体,并且新基因的表达产物可以通过抗体的融合部分检测。
WesternBlot通过显色法分类主要如下。放射自显影底物化学发光ECL底物荧光ECF底物颜色DAB是目前常用的化学底物化学发光ECL和底物DAB颜色,体水平和实验条件目前公布的第一种方法这些纸通常使用ECL化学发光底物。
只需购买一个现成的套件,操作相对简单,原理如下(二级标记抗HRP):如果发现HRP,反应底物是过氧化物+鲁米诺,即光,剥离胶片可以曝光
该实验是常见问题指南01参考指南中的建议A.
什么是初学者的最佳信息?
答:“抗体技术实验指南”和两本抗体书(alaboratorymanual,wrotbyEdHarlow,davidlane)都很好。
02关于02样本的常见问题这里有很多内容,但有些内容被省略了。有关更多信息,请单击[阅读原始]。
B.
Western Blot(以下简称Western Blot)对线粒体提取后线粒体膜的UCP2蛋白和De博士的第一抗体开始有一些痕迹。越来越差,样品量仍无法改变圣诞老人的一抗,正在加入120微克。
是什么原因?
是否添加了蛋白酶抑制剂和PMSF?
答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冷冻和解冻; 2,样品中不添加蛋白酶抑制剂。
同时,建议验证Western印迹以增加一抗的浓度。
为了添加蛋白酶抑制剂,通常可以添加PMSF,并且优选添加一些蛋白酶抑制剂。
C.
细胞水平需要蛋白质印迹。从Western印迹中提取的细胞数
答:一般5 * 106就足够了。
D.
您可以在同一样品中同时提取RNA和蛋白质,但WesternBlot是否会受到影响?
答:是的,没问题,我们做到了。
E.
我可以同时分析同一蛋白质样品的两种因子的Western印迹吗?
F.
如果目标蛋白质是膜或细胞质蛋白质,我们应该注意什么?
03抗体T.
细胞内信号传导的要求是什么,二抗磷酸化WesternBlot因子?
答:二抗没有要求。根据所选择的实验条件,通常建议使用标记有HRP的二抗。
U.
之前没有测试,因为其他公司的其他抗体在此稀释度下非常有效。这需要很长时间。哪种稀释更好?
我使用ELL + plus套件来开发颜色。
将膜孵育过夜,并将第一抗体孵育过夜。如果它在半夜关闭,则需要四天才能看到结果。
04滤纸,胶粘剂,胶片X有问题。
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